拉曼化学计量尿液分析（Rametrix）作为膀胱癌的筛查的好方法

　　膀胱癌 （BCA） 相对常见，可能复发/进行性疾病。检测、治疗和控制的成本也很高。通过检查尿沉渣、影像学检查、直接观察（膀胱镜检查）和可疑膀胱病变的侵入性活检来明确诊断。

　　膀胱癌 （BCA） 相对常见，可能复发/进行性疾病。检测、治疗和控制的成本也很高。通过检查尿沉渣、影像学检查、直接观察（膀胱镜检查）和可疑膀胱病变的侵入性活检来明确诊断。目前尚无普遍的使用的BCA特异性生物标志物尿液筛查试验，用于早期BCA或治疗期间/治疗后的后续患者。尿液代谢组学筛查的生物标志物费用昂贵，通常无法用于临床应用。作为回应，我们开发了基于拉曼光谱的化学计量尿液分析（Rametrix™）作为一种直接液体尿液筛查方法，用于检测与BCA和其他泌尿生殖道病变相关的尿液中的复杂分子特征。特别是拉梅特里克斯筛查使用尿液拉曼光谱的主成分（PC）来建立判别分析模型，以指示疾病的存在/不存在。包括的PC数量各不相同，所有模型都通过留一分析进行交叉验证。在这里报告的研究1中，个人会使用来自泌尿科诊所的56名同意患者的尿液样本测试了Rametrix™筛查。这项概念验证研究包含 17 份具有活性支链氨基酸（支链氨基酸阳性）的尿液标本、32 份来自其他泌尿生殖道病变患者的尿液标本、7 份来自健康患者的标本以及尿液分析对照 Surine.使用由 22 台 PC 构建的模型检测 BCA，准确率为 80.4%，灵敏度为 82.4%，特异性为 79.5%，阳性预测值 （PPV） 为 63.6%，阴性预测值 （NPV） 为 91.2%。根据包含的PC数量，我们找到了Rametrix。可以对筛查进行微调，以实现高灵敏度或特异性。在这里报告的其他研究中，Rametrix还能够区分来自BCA和其他泌尿生殖系统疾病患者的尿液样本和来自终末期肾病（ESKD）患者的尿液样本。虽然需要更大规模的研究来改善Rametrix模型并证明临床相关性，这项研究证明了Rametrix的能力筛查以区分支链氨基酸阳性患者的尿液。BCA患者尿液代谢组中的分子特征差异包括磷脂酰肌醇，核酸，蛋白质（特别是胶原蛋白），芳香族氨基酸和类胡萝卜素的变化。

　　BCA很常见，也是治疗成本最高的癌症类型[1]。预计2019年将诊断出超过80，000例新发病例（占所有新诊断癌症病例的4.6%），近18，000例患者将因肿瘤进展和治疗失败而死亡[2]。目前有超过577，400例患者正在接受治疗[3]。BCA的五年生存率为77.4%，早期疾病与更好的五年生存率相关（0-98%期，1-88期，2-63期）。更晚期（3-46%，4-15%）的五年生存率更差。大约30%的新发肌肉侵袭性病例在2-4期首次诊断[4]。

　　早期发现无症状的支链氨基酸是有问题的。临床症状（例如血尿、排尿困难、尿急、腰痛）的发作通常会引发进一步的临床和诊断性检查[5-7]。常规尿液分析对早期BCA检测没有帮助，样本中微量血尿的意义值得商榷[8，9]。有症状患者的BCA的明确诊断取决于影像学检查、尿液细胞学检查、直接膀胱检查（即膀胱镜检查）和BCA生物标志物检测[10-16]。目前基于尿液的生物标志物检测均未获得广泛认可，也没有成为筛查或患者随访的标准治疗[17-19]。

　　几个小组已经研究了使用尿液代谢组学分析来检测或临床随访BCA。Boutara和同事[20]使用尿液代谢组学分析来表征正常尿液中的数千种独特分子，以及Shi等。[21]回顾了目前关于BCA相关代谢组学标志物的文献。Burton和Ma[22]报告了BCA患者尿液中代谢途径的改变以及蝶啶，酰基肉碱衍生物和核酸代谢物的存在。在相关工作中，卡利姆和李[23]，郝等。[24]和克等。[25]使用血液和尿液的代谢组学分析来检测肾脏疾病，并产生了可用于区分上尿路和下尿路病变（如BCA）的独特数据。

　　所有当前的诊断程序，包括基于尿液的生物标志物的测试，要么（i）昂贵，（ii）需要某些特定的程度的专业相关知识才能获得有效的结果，（iii）侵入性，（iv）不可靠的灵敏度或特异性，（v）高度依赖于样本质量和肿瘤生长阶段，（vi）分析资源密集（例如，需要质谱），和/或（vii）无法扩展用于大规模筛查。一种简单，无创和可靠的筛查技术来检测BCA能够大大减少对不太可能患有癌症的患者进行侵入性和昂贵的评估测试的使用，并加快对那些患有癌症的患者的诊断和治疗。对于BCA监测，这种测试能改善疾病复发/进展的识别，并减少低风险患者的膀胱镜检查。

　　与其他一些肿瘤（例如前列腺癌）不同，BCA病例不能不治疗，因为它能预见地会出现症状并且无需治疗即可进展。越早诊断出肿瘤，BCA可治愈或可控的可能性就越大，或者能够正常的使用不太积极的治疗（即膀胱保留疗法）。因此，临床上可用于临床上对BCA风险增加的人群（例如烟草制品使用者;美国为2700万人）进行年度尿液分析[7]，用于监测BCA患者（超过577，000人）的治疗效果，并监测患者的肿瘤复发/进展。

　　我们开发了一种新颖的筛查技术，拉曼化学计量尿液分析（Rametrix）），用于检测尿液中的BCA标志物（多分子特征）。拉梅特里克斯基于尿液的拉曼光谱分析和光谱数据的多元统计分析。拉曼光谱本身是一种成熟、研究充分、功能强大的技术，已被常规应用于分析各种固体、液体和生物样品的化学成分[26-33]。为了做多元化的分析，样品被单色激光激发，所得光谱显示拉曼散射辐射（由化学键旋转、拉伸和弯曲产生）的强度与频率的关系[34]。当应用于尿液分析时，拉曼光谱具有以下优点：（i）它无标记，需要最少的样品制备，（ii）化学成分数据近乎/实时返回，（iii）来自水的光谱干扰最小（与红外方法不同），（iv）可以透过玻璃扫描，（v）它对样品无损，以及（vi）它可以很容易地缩放大量样品（通过自动化）。这些优点使拉曼光谱成为筛查尿液以检测BCA和其他尿路病变的着迷的方法。

　　尿液含有数百种反映新陈代谢和健康的分子，以及泌尿系统的重要生理活动[20]。成分在个体之间变化很大，事实上，每个人每天的成分差异很大，这取决于活动、饮食、新陈代谢、外源性药物和化学物质的摄入、水合作用状态和肾功能。在一次拉曼光谱扫描（5分钟内获得）中，这些分子中的许多分子能轻松可靠地识别为光谱带，这些光谱带可以与拉曼参考库中的分析标准品相关联。例如，通常用于评估健康和肾功能的小分子（例如尿素、肌酐、尿酸、葡萄糖）和大分子都会在特定波数下产生拉曼强度带。这些共同创造了尿液标本分子组成的独特光谱“指纹”。能够理解的是，BCA和其他膀胱病变的存在对尿液成分有深远的影响。这些成分变化存在于光谱指纹中，能够最终靠Rametrix中的多变量统计模型来解决。。

　　其他人已经认识到使用拉曼光谱研究尿路疾病（包括BCA）的价值。DeJong及其同事[36]能够在手术（切除）活检触摸制剂中区分与BCA细胞相关的独特拉曼特征。Bird及其同事[37]使用红外拉曼显微镜检测细胞学制剂中的BCA。Canetta及其同事[38]使用调制拉曼光谱来区分来自组织培养物的尿路上皮和膀胱癌细胞制备中独特的拉曼光谱特征。Shapiro及其同事[39]使用拉曼显微光谱法评估膀胱癌病变，并在波长1，584厘米处发现了独特的光谱带。-1区分肿瘤与非肿瘤组织以及低级别与高级别BCA。Kerr和同事[40]使用拉曼显微光谱法将膀胱癌细胞与其他尿液沉积物区分开来。Yang等人[41]为癌细胞上的特定受体创建了表面增强拉曼散射（SERS）测定。SERS的信号放大特性允许这些分子在液体尿液标本中被照亮。此外，基于拉曼光谱的Fe3O4已经开发出用于检测尿晶体的功能化表面，尿液晶体可能会继续形成结石[42，43]。

　　可以看出，关于使用拉曼光谱检测BCA的已发表文献中，很大一部分集中在细胞学制剂的评估上，一小部分集中在尿液代谢组的评估上。我们的拉美特里克斯独特的技术依赖于辨别液体尿液中的分子变化，使其更加实用，适用于标本的大规模筛选。在这里，我们报告了一项初步临床研究的结果，其中拉曼光谱与Rametrix LITE [29]和Rametrix™一起使用PRO [44] 光谱处理方法，用于分析来自BCA患者和其他泌尿生殖系统疾病患者的尿液标本。咱们进行了这项研究，以测试“独特的拉曼光谱模式（即分子指纹）与BCA相关，并能通过Rametrix在液体尿液中检测到的假设。我们将这些拉曼光谱分析的结果与来自健康志愿者的Rametrix™尿液分析[35]，患有终末期肾病（ESKD）[45]和合成尿液分析标准品（Surine).我们还评估了Rametrix通过计算其敏感性、特异性、阳性预测值 （PPV） 和阴性预测值 （NPV） 指标来筛查 BCA。这些指标对于评估筛查试验的潜在有用性至关重要[46]，因为高敏感性（真阳性筛查结果）可提高BCA病例的识别率，而高特异性（真阴性筛查结果）可最大限度地减少可能导致不必要（和侵入性）检查的假阳性筛查结果[47]。

　　这项研究得到了弗吉尼亚联邦大学IRB#HM20006879的批准;弗吉尼亚理工大学 IRB #VT-IRB 15–703;和Frenova研究协议RPP/177151.2（费森尤斯肾脏研究;920 Winter Street，Waltham，MA 02451）。从本研究的所有受试者那里收集尿液标本获得了知情书面同意。标本取自（i）2016年9月至2017年4月期间在大型三级医疗中心泌尿科诊所就诊的患者和志愿者;（ii） 隶属于弗吉尼亚理工大学的健康志愿者;以及（iii）接受腹膜透析治疗ESKD的患者。在采集时，标本被去识别化并分配了一个代码。

　　在IRB批准并获得患者书面同意后收集尿液标本;下面提供了每组患者的详细信息。在分析前将标本在-35°C下储存不超过四周;这些条件保持了拉曼特征的真实性（见下面的试样稳定性验证）。将储存的标本在37°C的培养箱中解冻约25分钟，以准备分析。然后将总共 1.5 mL 的每个尿液标本等分到玻璃小瓶中，然后密封。在拉曼扫描之前，对含有沉淀物的标本进行短暂涡旋以重新悬浮并溶解沉淀物。苏林（Dyna-Tek Industries，Lenexa，KS）是一种合成分析标准品，被用作尿液分析对照，也以类似的方式制备。

　　使用PeakSeeker将尿液标本作为散装液体进行分析色散拉曼光谱仪（阿吉特龙;马萨诸塞州沃本）。使用785 nm 100 mW激光强度对每个标本进行10次扫描，每次扫描之间的曝光时间为15秒，延迟为15秒。标本按随机顺序扫描，苏林扫描每批尿液标本。

　　如上所述，从泌尿科诊所就诊的56名受试者（患者和志愿者）获得尿液标本。这项研究的样本量由收集期持续时间决定。研究人群的特征在表1.中游游离捕获尿液标本是在研究对象的无菌样品杯中获取的。在使用上述方法进行拉曼扫描之前，可以保持样品的完整性。在收集过程中记录患者诊断，以便将结果与分析数据相关联。

　　BCA阳性患者尿液的分子组成与正常尿液的分子组成不同，这能够最终靠拉曼光谱和Rametrix检测到.此外，发现BCA尿液的拉曼光谱也与ESKD患者尿液不同[35，45]和其他GU疾病患者的尿液。我们能够使用拉曼数据和Rametrix。计算以确定BCA阳性尿液特有的光谱特征以及这些标本的代谢组。虽然我们能够对主要光谱差异（例如，胶原蛋白，DNA，磷脂酰肌醇以及结果和S1文件中提到的其他差异）进行分子分配，但我们注意到存在几个次要贡献者，并且可能也很重要。这些例子可能包括NMP-22等生物标志物和膀胱癌尿液中存在的膀胱肿瘤相关抗原[51]。然而，由于拉梅特里克斯依靠化学计量学（即从代表许多分子的拉曼光谱中提取信息），不需要在标本中特异性鉴定单个生物标志物来构建有效的BCA尿液筛查。该分析专门检测疾病的广泛代谢组学特征。因此，它是许多分子因素（目前一些未知）的组合，导致BCA阳性尿液明显不同。尽管如此，我们已经开始使用拉曼光谱参考库将这些光谱差异与特定代谢物和模式相关联的过程，我们假设这可能会导致一组新的BCA代谢组学生物标志物（即分子特征）。然而，需要更多的研究来验证这些最初的光谱发现，包括更多的患者样本，使用几种分析标准品，并探索导致分子特征差异的次要成分。我们预计没有特定的分子或小亚群可以单独指示BCA。很可能使用Rametrix分析的整个分子特征，有必要将尿液代谢组与BCA的存在联系起来。使用Rametrix的留一分析PRO 确定 DAPC 模型在表征新尿液样本方面的表现。拉梅特里克斯的结果用于识别泌尿科诊所数据集的支链氨基酸阳性和支链氨基酸阴性患者的模型（表3与 22 台 PC）用于进一步说明灵敏度、特异性、PPV 和 NPV 的概念。在患者群体中，所有通过黄金标准（即诊断测试和体格检查）检测BCA呈阳性的人中，其中82.4%的人使用Rametrix检测呈阳性筛查试验（敏感性）。在这个人群中，在那些通过黄金标准检测呈阴性的人中，这些人中有79.5%的人会对Rametrix检测呈阴性筛查（特异性）。在所有对Rametrix检测呈阳性的人中屏幕，其中63.6%的黄金标准（PPV）检测呈阳性。最后，所有测试阴性与 Rametrix其中91.2%的黄金标准（NPV）检测也呈阴性。我们当然承认，敏感性、特异性、PPV和NPV等值仍达不到临床相关性，这需要进一步研究。然而，鉴于样本量有限（即泌尿外科诊所患者数据集中有56个标本），我们认为这项研究可以作为有效的概念验证。由于敏感性、特异性、PPV 和 NPV 都超过了 BCA 阳性或 BCA 阴性指定的随机机会值 （50%），我们认为有理由对 BCA 患者和其他 GU 病理患者进行更大规模的临床研究，这将改善这种拟议的尿液筛查的这些指标。

　　我们还认识到，DAPC 模型架构能够最终靠包含不同数量的 PC 来改变，并且本研究根据性能选择了性能更好的模型。在未来针对更大患者群体的研究中，我们预计不同的模型结构将呈现为最佳状态，直到建立临床相关的尿液筛查。一旦在临床上使用，模型架构将保持静态。在这项研究中，我们表明，通过调整用于构建模型的PC数量，Rametrix的灵敏度或特异性更高。可以进行筛选测试。高灵敏度可确保识别出更多真阳性BCA病例，并推荐用于进一步的金标准（即确定性诊断）检测。同样，最大化PPV可能很有用，因为筛查呈阳性的人更有可能通过黄金标准检测呈阳性。鉴于BCA金标准检测所需的侵入性和资源，高PPV是筛查试验的理想属性。这也有利于最大化特异性（即真阴性率）以最小化假阳性率。那些被屏幕错误地识别为BCA阳性的人必须接受金标准测试（如果Rametrix，就会发生这种情况。屏幕不存在），并根据这些测试和检查的结果重新分类为 BCA 阴性。扩展的临床试验和对成本/收益的全面分析将使Rametrix能够正确调整模型和指标，以更好地与临床目标保持一致。当然，存在构建多个Rametrix的选项每个模型都经过调整以支持不同的指标。可以设计进一步的黄金标准测试，以应对Rametrix中的哪一个或多少个。模型返回支链氨基酸阳性结果。此外，除了“BCA阳性”和“BCA阴性”之外，进一步的发展可能包括“有风险”的预测。这种新的“风险”分类将源于我们训练数据集的 DAPC 图中的重叠区域。这些在无花果中很明显3,5和6在这项研究中。当然，要考虑上述所有情况，还需要更大规模的临床试验。

　　除了这些观察结果之外，我们还注意到DAPC模型的预测能力受到用于构建模型的光谱数据集大小的影响。包括更多的光谱通常会提高预测性能，但阳性和阴性样本的数量应保持相对平衡。还应注意确保即使是负样本也能代表将执行预测的环境。使用包含许多潜在混淆因素（例如，与感染性膀胱炎相关的血尿和脓尿）的阴性样本将降低估计的敏感性，但更准确地描述最坏情况下的真实预测能力。然而，如果拉梅特里克斯与其他技术或已知患者病史结合使用，可以缩小适用的阴性训练数据的范围，从而改善筛查指标。

　　例如，在这项研究中，健康志愿者数据集主要由健康的大学生志愿者组成（中位年龄= 22）;然而，泌尿外科诊所患者数据集的中位年龄要高得多（62岁），并且包括很大一部分患有其他GU疾病的个体。如果要设计癌症复发的筛查策略，年轻健康的个体可能不是训练数据的代表性来源。在这项研究中，与缓解期的支链氨基酸患者相比，使用BCA阳性光谱测试了复发筛查场景，但预测没有超过随机机会，这主要是由于缓解患者的样本量小。在扩展的临床试验中，这些人群中也需要更加多的患者。

　　有了足够大的数据集，Rametrix表明该技术能够在这项研究中区分不一样的疾病。它不但可以区分BCA和ESKD，而且还揭示了区分不同GU条件的能力。然而，这些区别的预测能力会比较低，这在很大程度上是由于人口规模有限和该类别中汇总的各种条件。在这项研究中，根据性别建立单独的屏幕也是如此，其中低人口规模是限制因素。然而，在临床环境中，这一些因素将很重要，应纳入单个尿液筛查或根据特定患者标识符使用单独的筛查。在扩展的临床试验中，必须扩展这些观察结果，并仔细考虑人群规模和组成，以包括可能会影响尿液成分的条件。

　　有了足够大小的光谱数据集，Rametrix为BCA筛查提供了一种着迷的方法。更明确的诊断总是依赖于尿液细胞学检查和膀胱镜检查，但 Rametrix作为筛选方法具有几个优点。拉梅特里克斯的尿液分析比膀胱镜检查的侵入性小得多，不需要训练有素的病理学家，需要相对便宜的设备和用品，并且技术人能远程获得结果。我们设想拉梅特里克斯也用于早期和常规筛查发生BCA的高风险个体，如重度吸烟者[52]或塑料厂工人[53]。拉梅特里克斯具有筛查治疗后的支链氨基酸患者复发迹象的潜在用途。我们打算用从正在进行的临床研究中获得的样本来扩展这项研究的结果。

　　拉梅特里克斯LITE 包括步骤 1、3 和 4。拉梅特里克斯唰唰PRO 包括步骤 2、5-10。