HPLC法测定“有关物质”时已知杂质的计算方法

  而“有关物质”是杂质的一种，主要是指有机杂质。有关物质是药品重要的质量指标，原料药、口服制剂、注射液等质量控制指标中均有该项目，其可以反馈药物的纯度与安全性等。

  它的检查方法很多，而其中的HPLC法具有专属性强、分离效果好、灵敏度较高、分析速度快、重复性好、操作简单便捷等诸多优点，而且能与多种类型检测器联合应用，能满足大多数化合物种类的检测需要。

  HPLC法测定有关物质中已知杂质的测定方法很多，计算方式也相应很多，每种计算方式都有不同的意义及其优缺点，下面参考各种文献，结合实际在做的工作，对这些计算方式作一简单探讨。表1是各种计算方式的计算公式及其主要优缺点。

  按各品种项下的规定，配制供试品溶液，取一定量注入仪器，记录色谱图。测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。

  具有与称样量及进样量基本不相关的特点，因此重复性和重现性均良好，不需要折算，降低了实验中对称样量精密度的要求，降低了检验成本，操作更简便、快捷，省去了计算过程。

  但当杂质是微量的时候需增加方法的灵敏度，就要增加进样量，此时主成分可能超出仪器检验测试范围，或虽然在仪器检验测试范围内，理论上讲此时可能与主成分不在同一线性范围内。

  《中国药典》2005年版二部附录中特别强调“本法通常只能用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查” 这也在某些特定的程度上限制了本法的使用。

  本法是配制一个浓度与杂质限度相当的供试品溶液作为对照溶液，一般是由供试品溶液直接稀释得到。本法不需要杂质对照品，当没有办法获得杂质对照品时，可采用不加校正因子的主成分自身对照法来计算杂质的含量。本法也是在假定供试品溶液中所有成分均出峰、所有杂质均与主成分分离且各杂质和主成分的响应因子均相同的前提下进行的。

  本法的优点同面积归一化一样，是简单易操作、运算方便，无需杂质对照品；缺点是忽略了各杂质与主成分的响应因子可能不同的事实，导致了实验测得的杂质含量可能与真正的杂质含量不一致。

  此外，不加校正因子的主成分自身对照法会存在稀释步骤、进样针和进样阀残留、进样误差等影响因素，往往也会导致计算出的杂质与真实含量之间有一定的误差；但不加校正因子的主成分自身对照法能解决面积归一化法中也许会出现的仪器检验测试范围和线性范围问题。

  在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种项下，用于校正杂质的实测峰面积。这些需作校正计算的杂质，通常以主成分为参照，采用相对保留时间定位，其数值一并载入各品种项下。

  该方法的操作步骤在计算时把杂质相当于主成分的响应因子考虑进去。本法相当于一个简化的内标法，同时也是对杂质对照品外标法的简化，即在研究方法学时，利用杂质对照品和主成分对照品，分别测定杂质和主成分的线性方程，以斜率之比计算杂质相对于主成分的校正因子，此校正因子可直接载入品质衡量准则中，在常规检验时用以校正该杂质的实测峰面积。在实际测定时，可采用相对保留时间进行杂质定位。

  此法的优点是在日常检验中省去了杂质对照品(特别是在杂质不够稳定或将来供应有困难时显得尤其重要)， 同时又考虑到了杂质与主成分的响应因子可能不同所引起的测定误差；缺点是相对保留时间在不同实验室间可能有所波动，特别是当供试品中存在多个杂质而又分离不好时会造成杂质定位困难。

  需要指出的是，如果已知杂质对主成分的相对响应因子超出0.9~1.1范围时，宜用加校正因子的主成分自身对照法或杂质对照品外标法法进行计算。

  《美国药典》多采用加校正因子或不加校正因子的主成分对照品外标法来对已知杂质进行计算。

  主成分对照品外标法包括加不校正因子的主成分对照品外标法和加校正因子的主成分对照品外标法。操作、计算分别与不加校正因子和加校正因子的主成分自身对照法基本一样，唯一不同的是前者要用主成分对照品制备一个浓度与杂质限度相当的溶液作为对照品溶液，后者是由供试品溶液直接稀释得到一个浓度与杂质限度相当的溶液作为对照溶液。

  由于主成分对照品是经过标定的，其纯度或量值会比较准确，而制剂中主成分的实际含量与标示量有时会不完全一致，因此采用对照品外标法计算出的杂质的实际绝对含量要比自身对照法准确一些。当然，由于本法要使用主成分对照品，因此导致操作成本会提高一些，操作的流程会繁琐一些。

  杂质对照品外标法要求提供一定纯度的杂质对照品，分析时需制备一个浓度应与杂质限度相当的溶液作为杂质对照品溶液。由于杂质对照品外标法能解决上述几种测定方法和计算方式存在的种种问题，特别是杂质与主成分响应不一致的问题，因此，本法能反映药品中该杂质的真实含量。

  如果杂质对照品容易获得并能持续供应，建议在有关物质检查中已知杂质的测定和计算时首选该法，特别是当该杂质与主成分的相对响应因子相差较大(超出0.9~1.1范围)或该杂质有毒副作用时，欧美药典中采用此法进行有关物质计算的品种也不在少数。

  虽然杂质对照品的获得和供应很难，在国家药品标准中是否引入杂质对照品应权衡并慎重，但由于该法能真实反映药品中某一杂质的含量，因此采用杂质对照品外标法应该是今后有关物质检查时努力的方向。

  按各品种项下的规定，分别精密量取含有一定浓度内标物质的对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定对照品溶液中对照品和内标物质的峰面积及供试品溶液中待测成分(这里指待测杂质)和内标物质的峰面积，根据表1中的公式计算杂质的含量。

  内标法主要是未解决仪器进样精密度和药物中所含成分的回收率的问题，这种办法能够抵消仪器和过程带来的误差。但在以常压六通阀定量环进样和回收率已经验证的情况下，意义已不大，加之内标物质的选择很难，内标物质的添加会导致分离难度的增大，操作的流程更加烦琐等问题，本法已经使用很少。返回搜狐，查看更加多