利用液滴微流体技术提高尿细胞图像分割效率

　　这项研究提供了第一个概念验证迹象，表明用液滴微流体封装单个细胞能轻松实现细胞图像分割。

　　使用机器视觉识别生物样本的最新进展使该技术在研究和检测中慢慢的变重要。图像分割是这一过程中的重要一步。本研究的重点是如何根据微流体减少不一样（或同一类型内）尿细胞之间的重叠等干扰因素，并提高细胞图像的机器视觉分割精度。在这项研究中，我们证明了该平台能够以尿细胞图像分割为例实现这一假设。我们第一步讨论报道的尿细胞液滴微流控芯片系统，该系统能实现将尿细胞封装在液滴中并从盐结晶和/或细菌和其他尿液形成元素中分离出来的测试条件。然后，根据前述实验中设定的分析条件，测量同一尿样中总尿细胞中各种形成元素覆盖的红细胞、白细胞和鳞状上皮细胞的比例。我们同时分析了盐结晶覆盖的尿细胞百分比和尿细胞之间重叠的发生率。最后，使用Otsu算法对液滴封装的尿细胞图像和未被液滴封装的尿细胞图像进行分割，并计算骰子、Jaccard、精度和召回率值。结果表明，基于液滴的单细胞封装方法在不优化算法的情况下，可以提高图像分割效果。

　　在生理条件下，尿液中含有白细胞（WBC）和上皮细胞等元素。当患者患有膀胱癌时，膀胱肿瘤细胞可以通过尿液排泄。1通过这种方式，尿液中细胞类型的液体活检，特别是肿瘤细胞的检测，有助于膀胱癌和泌尿系统疾病的诊断。目前，在临床医学检查中，自动检测技术为尿液细胞学铺平了道路。2

　　自动化尿沉渣分析技术的出现，使其在临床医学检查领域得到迅速应用。3随后，许多研究评估了尿沉渣分析系统的检测效果。据报道，自动尿沉渣分析系统检测碱性尿颗粒的成功率为73%-98%。4当尿液中存在高浓度的细菌和/或酵母时，尿液中的红细胞（RBC）值显着增加，这相应地增加了检测尿细胞的错误率。根据报道的研究结果，这些沉积物分析系统尚未达到尿细胞准确鉴定的水平，仍需要由细胞形态学专家进行鉴定，以报告尿液细胞精确数量和类型的检查结果。5、6

　　根据临床经验，发现尿沉渣中尿细胞、盐晶体和病原微生物相互重叠，或者尿盐晶体和粘液丝粘附在尿细菌表面。具体而言，对于患有尿路感染，膀胱炎，膀胱癌和其他疾病的人，其他成分对尿细胞的覆盖率高于健康人。7、8

　　在基于细胞形态识别尿细胞类型的过程中，尿细胞与其他形成元素之间的粘附和/或重叠是导致尿细胞类型错误识别的因素之一。9已经有几份研究报告探索图像识别模型以提高图像识别算法的性能。10近日有报道称，算法的改进逐渐增加了细胞识别效果。票价：11、12根据目前的文献，在临床应用机器视觉识别尿细胞的过程中，对影响尿液中细菌、盐晶体和其他可见成分干扰因素的因子进行识别尿细胞缺乏系统研究。

　　近年来的研究报告表明，基于微流控技术，能轻松实现生物细胞的单细胞分析，分子表达和遗传特征。票价：13、14值得注意的是，检测血液循环肿瘤细胞的技术已经通过了美国食品和药物管理局的认证。15郑和伊斯马吉洛夫16描述了一种微流体系统，用于筛选数百种蛋白质结晶条件，每个结晶液滴使用少于4nL的蛋白质溶液。从那时起，基于液滴的单细胞分析一直专注于多个科学领域的发展，例如单细胞代谢，17细胞免疫学，18细胞蛋白质组学，19基因组学，20和药物筛查。21最近，关于液滴微流控芯片技术在单细胞分析中的应用已经有许多研究。液滴微流体技术引入了两个不相容的液相，提供了对单个细胞的生物代谢特征和细胞图像特征的合适分析，减少了其他因素的交叉污染，同时提供了高通量样品离散化的独特优势。22幸运的是，有研究表明微流体技术可以实现图像识别。票价：23、24其中许多研究结合了图像识别和液滴分类技术，以促进后续分析，例如浮游生物物种，25人类红细胞，26甚至是3D细胞培养球。27基于这些研究，我们认为液滴微流体技术有可能改善基于机器视觉的尿细胞识别结果。

　　本研究探讨了利用液滴微流控芯片技术减少尿液中细菌、粘液、晶体等成分对计算机视觉方法提取的尿细胞形态特征的干扰作用，进一步为改进利用CAD系统分析尿液细胞分析技术提供研究依据。

　　根据临床诊疗指南，对临床诊断出的尿路感染、膀胱癌、肾病综合征患者的尿液进行单独采集。在2小时内收集的每个患者样本的10ml中，一部分用于尿细胞形态学诊断，另一部分用于以下实验。所有人体材料都是根据经批准的机构审查委员会协议获得的。在纳入之前，已获得所有参与者的书面知情同意。

　　将尿液和Sternheimer-Malbin（S-M）染色溶液以4：1的体积比混合，染色时间为3分钟。每个细胞由三位病理学家鉴定，并计算各种类型尿细胞的平均百分比。

　　在应用液滴微流体处理之前，使用iQ200自动尿液显微镜分析仪（iQ200;IRIS，Chatsworth，CA）获得有关其内容的基本信息，并对每个标本进行重复测量三次以计算平均值。我们选择并混合了10个包含许多不同类型的标本。混合标本用于生成足够的图像数据以供后续分析。

　　微流体芯片由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成。PDMS层的制造方法如下：将预聚物与固化剂（Sylgard 184，道康宁，米德兰，MI）混合，将所得溶液以10：1的比例倒入预制面罩中并在80°C下固化2小时;然后将固化的PDMS薄膜剥离并通过氧等离子体工艺粘合到玻璃基板上（Diener electronic，Ebhausen，德国）。芯片掩模是使用AutoCAD（Autodesk;索萨利托，加利福尼亚州）。

　　步骤 1：最大类间方差法 （Otsu）28用于将图像划分为前景（单元格）和背景。用于图像分割的大津方法的原理如下：

　　(1)内部类方差：(2)因为(3)然后(4)其中w0(t） 表示按阈值t分类的两种类型的图像的前景像素比例：(5)w1(t） 表示按阈值 t 分类的两种类型的图像的前景像素比例：(6)u{0，1，T}(t） 表示前景、背景和整体图像的平均灰度值：(7)(8)(9)步骤2：扩张和侵蚀，以平滑图像的边缘。膨胀是合并与对象接触的所有背景点并向外扩展对象边界的过程。膨胀可以填充前景图像中的小孔和小凹陷。结构元素B（背景）到图像A（前景）的膨胀是A⊕B，定义为

　　(10)侵蚀是膨胀的双重操作，这是消除边界点并使边界向内收缩的过程。侵蚀可以消除小而无意义的物体。结构元素B（背景）对图像A（前景）的侵蚀是A⊖B，定义为(11)步骤3：评估两组尿细胞图像的分割结果。

　　在尿细胞图像的研究中，有两组细胞图像：一组是液滴封装的细胞图像组，另一组是非封装组。对于每个细胞图像，细胞区域由细胞病理学专家和自动计算机辅助分割方法标记。自动分割与手动分割建立的地面实况进行了比较。使用几个评估参数（如骰子，Jaccard，精度和召回率）评估用于图像分割的液滴微流体的性能。这些参数的计算方法如下：(12)(13)其中X和Y是指比较的两个分割标签，其中一个是基本事实，十和是的分别指X和Y中的像素数。(14)(15)其中 TP = 真阳性，TN = 真阴性，FP = 假阳性，FN = 假阴性。系统的整体流程图如图1所示。微流控芯片的细节如图S1所示。

　　尿细胞分析系统的整体流程图。（A）同一试样经过传统制膜和微流体系统两种方法。通过在显微镜下使用CCD相机获取细胞图像，然后输入到计算机进行图像分割。（B）尿细胞在微流控芯片中形成液滴的过程。（C）自动细胞图像分割[颜色图可以在

　　该实验中使用的尿细胞来自患者的尿液样本。确定尿细胞类型的程序如下：首先，用S-M染色对尿细胞进行染色;然后，三名细胞病理学家对每个细胞进行形态学鉴定。对于同一细胞，当三位细胞病理学家中的一位或多位存在争议时，该细胞被排除在本研究中;之后，根据尿细胞的形态学特征，观察到白细胞，上皮细胞和红细胞中细菌，粘液丝和细胞之间重叠的现象（如图2所示）。最后，标记了由三位细胞病理学家鉴定的每个细胞的轮廓。

　　Sternheimer-Malbin（S-M）染色的尿细胞。（A）SECs和盐晶体的重叠。（B）白细胞（WBC）和长杆菌的重叠。（D）SEC的重叠;（E）红细胞（RBC）、细菌和WBCs的重叠;（F）WBC和粘液丝的重叠[颜色图可以在

　　液滴微流控芯片系统包括载体注油通道、尿细胞注入通道和液滴储罐。微流控芯片系统的工作流程如下：首先，将载体油和尿细胞同时注入微流控芯片。然后，通过微流控芯片的流体动力学效应，将尿细胞逐个封装以形成液滴（如图1所示）。

　　为了研究液滴产生的条件，当注入微芯片的微流体的总流速为6ml / h时，观察到微流体芯片中产生的液滴的直径。实验根据结果得出，当油相与水相的比例达到1.6（油= 3.7 ml / h，缓冲液= 2.3 ml / h）时，在微芯片中观察到液滴。当比例超过2（油= 4.0 ml / h，缓冲液= 2.0 ml / h）时，液滴直径基本恒定。然而，当比率超过2.75（油= 4.4ml / h，缓冲液= 1.6ml / h）时，形成的液滴的直径显着不同（如图3（A，B）所示）。另一方面，我们将两相比固定在2：1并调整总流量。在每个流速下产生的液滴的直径相对一致（图3（C，D））。

　　在各种参数条件下产生液滴。（A）液滴直径与所施加的油水流速比的相关性。我们将注入设备的油相和水相的比例范围从1（3 ml / h：3 ml / h）调整为2.75（4.4 ml / h：1.6 ml / h）。（B）在各种油水流速比条件下产生的液滴图像。I：1.5，II：1.6，III：1.7和IV：2.0。（C）液滴直径与施加的总流量之间的相关性。我们将注入设备的总流速范围从0.6调整为6.0ml / h.（D）在各种总流速条件下产生的液滴图像。I：0.6， II：0.75， III：1.5， 和 IV：3.0 [彩色图形可以在

　　基于上述结果，我们确定了以下参数：注入微流控芯片的总流速为6ml / h。油相的注射流量为4 ml / h，水相的喷射流量为2 ml / h。换句话说，注入芯片的总流速为6 ml / h，油相与水相的比例为2：1。

　　每个液滴内的细胞数量可以使用泊松分布来估计，29其中，每个液滴找到x个细胞的概率P（X = x）由以下等式给出：

　　利用液滴微流控技术，将尿细胞封装在液滴中，将尿细胞与尿液中的非细胞元素分离，从而实现高通量样品离散化。我们认为，当液滴中封装的细胞数量为0或1时，计算机视觉方法有助于识别尿细胞图像。

　　在这项研究中，当注入芯片的细胞浓度为2.7×104cell/ml，将细胞封装在整个芯片存储池中的液滴的阳性率小于1%。随后的实验是逐渐增加注射到芯片中的细胞数量。当注射到微芯片中的细胞浓度增加到2.7×106细胞/ml，芯片中细胞液滴的阳性率达到21.08%（如图S2所示）。液滴的半径约为30μm，液滴的体积为113 pl。根据等式（16），计算结果为λ= 0.23，实际检测结果为λ= 0.21±0.08。据报道，由液滴微流体引起的泊松分布可能会降低其高通量。31然而，本文旨在研究液滴微流体是否能大大的提升尿细胞图像的识别性能。此外，还有多种方法可以克服液滴包封电池的泊松分布。32、33

　　对同一尿液样本进行两次实验。尿细胞的第一部分直接用S-M染色，并在显微镜下获得细胞图像。将尿液细胞的第二部分注射到微流体芯片中，并获得由液滴封装的细胞的图像。在两个实验中获得的每个细胞由三位细胞病理学家鉴定，以鉴定其细胞类型并手动标记细胞轮廓。然后，通过计算机视觉方法自动标记轮廓。实验结果表明，在尿细胞封装之前，尿细胞在细胞之间重叠，被细菌覆盖或被盐晶体覆盖（图2）。尿液经液滴微流控装置处理后，尿细胞被包封在液滴中。一个更显着的现象是，其他可见成分，如尿粘液丝，细菌和染色溶液的残留物可以从液滴中排除（图4）。

　　封装在液滴中的尿细胞的图像。（A）液滴中的单红细胞（RBC）。（B）液滴中的单白细胞（WBC）。（C） 液滴中的单个 SEC。（D） 液滴中的细菌。（E）液滴中的盐晶体。（F）液滴外的纤维丝[颜色图可以在

　　液滴芯片操作前后尿液中各种形成元素重叠和粘附的组成比例的统计分析如表1所示。实验结果表明，对于尿液中的三种类型的细胞（红细胞，白细胞和SEC），液滴包封后重叠率均显着降低。红细胞的重叠率降低了25.3%，白细胞的重叠率降低了67%，鳞状上皮细胞（SECs）降低了40%。此外，液滴不仅封装在尿液中的单个细胞（图4（A-C）），而且还分离细菌（图4（D）），晶体（图4（E））和杂质（图4（F））。当尿液中含有细菌，盐晶体和杂质时，通过约100 pL的高通量液滴实现单细胞。综上所述，可以证明液滴微流体具有降低计算机辅助尿细胞识别方法错误率的潜力。

　　临床尿细胞检查的目的是准确识别尿细胞的类型和数量。基于图像的检测显示了如何准确分割细胞以及如何从整个载玻片图像中提取特征。探索减少尿液中可见光成分对图像分割的干扰的技术将成为基于计算机视觉的细胞分析的研究热点。本研究采用Otsu算法对封装和未封装的尿细胞进行分割，使用Dice、Jaccard、精度和召回率来评估分割结果。34我们主要关注尿液中3种细胞在5种常见干扰情况下，共13个场景，如表1所示，并对封装前后的分割效果进行了比较分析。在此之前，我们采用传统方法，利用Otsu算法在载玻片上分割单个细胞，然后计算出本实验中用于评估分割效果的四个参数，以证明我们算法的可信度。此外，在这项研究中，这已被用作良好分割效果的基线。将封装和未封装的尿细胞与标记区域的地面真实值和算法分割进行比较。最后，计算了两组每个样品的4个参数。在基于传统尿细胞形态学技术（非包封）的检测中，将尿细胞与其他粘附元件分割在一起以形成最终的细胞图像（如图5所示）。在对液滴微流控装置进行预处理后，可以确定RBC，WBC和SEC都获得了更好的分割结果，这与地面事实高度吻合（图5）。实验结果表明，红细胞、白细胞和SEC的Otsu分割和人工分割之间的4个值在被液滴包封时均接近1且接近单个细胞的分割效果，除非包封细胞召回外，三个值远小于1（如图6所示）。).这表明，当被液滴封装时，尿细胞轮廓的相似性可以显着增加，这有利于基于计算机视觉的识别方法。

　　Otsu对封装和非封装细胞图像的分割结果。（A）大津分割和手动注解的比较。（B）在预处理前后，在含有（1）杂质，（2）线）单白细胞（WBC）和（4）包封在液滴内的单个WBC的边界盒内的Otsu分割结果[颜色图可以在

　　使用相同的分割算法，基于液滴包封的细胞和非液滴封装的细胞，计算尿细胞图像的四个评估参数。尿细胞的类型是白细胞（WBC），红细胞（RBC）和SEC。此外，我们在四项临床检查中观察到干扰尿细胞形态学图像的机器干扰因素对细胞图像识别的影响。其中，通过液滴微流体检测尿液预处理后的细胞图像只有单细胞一种类型，而基于非液滴包封细胞检测细胞的细胞图像包括五种类型的细胞图像，即细胞重叠、晶体覆盖、粘液丝覆盖、细菌覆盖和单细胞。

　　液滴微流控技术具有高通量样品离散化的特点，为支持基于微流体的尿细胞图像分析提供了理论依据。据我们所知，这是首次使用液滴微流控芯片来分离尿细胞，以基于计算机辅助方法实现更好的尿细胞图像分割结果。目前，基于计算机视觉的方法提高细胞图像识别的性能可以从以下两个方面进行优化：一是提高图像识别算法的性能。相关研究成果已在临床实践中得到应用;其中，基于图像的尿细胞自动识别系统已成为计算机视觉和医学成像领域的热门线随着计算机视觉的发展，细胞图像识别的效果逐渐提高。37在计算机视觉辅助临床医学诊断的实际应用中，很多病例都没有将完美的幻灯片图像用于训练数据，这是与提高医学图像识别能力相关的一个关键因素。38另一种是在样品制备过程中去除干扰物质。基于液体的细胞学是解决这一方面的解决方案。支持这种解决方案的基本理论是，一些研究发现，基于液体的细胞制备技术可以降低细胞之间的重叠比。39然而，这种从液体中收集细胞的方法是否可以提高尿液细胞学的准确性仍然存在争议。40、41

　　在这项研究中，我们提出了另一种优化尿细胞的解决方案，以便图像可以适应细胞图像分割算法。如图6所示，导致传统标本图像分割不良的主要因素是精度低。相反，召回值不会表现出较弱的表现。我们假设在不改进算法的情况下，对于尿液样本，该算法更有可能产生比假阴性更多的假阳性。这在分割标记图像中直观可见，算法分割更容易出现错误扩展而不是错误还原。42前者的根本原因是尿液中还有其他形成的元素。43在这项研究中，尿液被液滴微流体装置离散化，以便每个形成的组分单独封装在液滴中，因此最终的图像分割更专注于目标而不会受到其他形成元素的干扰。对3种细胞的13种样品进行总结，包封前后，精度值从0.489±0.267增加到0.914±0.030，召回率值从0.768±0.242增加到0.983±0.009。我们还通过测量骰子和Jaccard值比较了算法的分割和真实值之间的相似性，总结了封装前后的3种细胞的13种类型样本;两个参数分别从0.501±0.217和0.373±0.225增加到0.947±0.018和0.900±0.032。需要注意的是，本实验结果表明，包封前后细菌粘附的鳞状细胞的分割效果没有差异。原因是细菌和鳞状上皮的面积有很大不同，因此对最终参数的计算影响较弱。44然而，值得指出的是，细菌粘附的鳞状上皮会改变其自身的图像信息，从而对进一步的识别产生不利影响。45封装后，这些细菌大部分可以被消除，这为进一步鉴定奠定了良好的基础。46我们在分割单个单元格时使用参数值作为基线。可以看出，在采用相同算法的前提下，使用液滴微流控装置处理同一试样前后的四个参数均得到改善。更重要的是，封装后的分割效果与单个细胞的分割效果相当，这证明了我们利用液滴微流控技术实现生物图像分割的假设是准确的。图像分割是影响后续处理步骤性能的关键图像处理任务。47目前，液滴内细胞分割算法正在逐步发展。48、49此外，有关于使用液滴微流体技术进行细胞图像分析的报道，指出能轻松实现细胞类型的测定。50本研究中提出的概念可能适用于涉及液滴微流体或图像识别的其他应用。

　　这项研究提供了第一个概念验证迹象，表明用液滴微流体封装单个细胞能轻松实现细胞图像分割。为了突出这一概念的一个应用，我们报道了一个液滴微流体平台，该平台可以将尿细胞封装在液滴中，而细菌，盐晶体等则被排除在液滴之外。液滴微流控平台实现稳定液滴生成的条件是总流量必须为6ml / h，油相与水相的流速比必须为2。我们证明，在使用液滴微流体后，四个参数，即骰子，杰卡德，精度和召回率，用于评估图像分割提高了。更重要的是，这些参数达到了与分割完美幻灯片图像时相同的水平。未来，我们将有兴趣研究液滴微流体与图像处理和识别的组合